富含生物活性因子丨SIS材料中生長因子的定量檢測研究

作者：本站編輯    發布日期：2022-06-16

博輝瑞進具有自主知識產權的SIS生物材料，主要成分包含 I、III 型膠原、纖維連接蛋白和多種生長因子(TGF-β、VEGF和FGF等)。生長因子是由多種細胞分泌，作用于特定的靶細胞，調節細胞分裂、基質合成與組織分化的細胞因子，有助于細胞功能的增強和血管化的形成。

本文重點對SIS材料中三種生長因子(TGF-β、VEGF和FGF)進行定量檢測，并通過兩種實驗方法得出檢測結果。該文章已于2018年5月發表于《材料科學》期刊，以下為部分摘錄內容。

圖為：2018年5月《材料科學》期刊封面

生長因子介紹

TGF-β，是一種豐富的骨基質蛋白，也是一種肽類抗炎癥生長因子，廣泛存在于正常組織及轉化細胞中，在血小板和骨組織中含量較高，在骨形成和骨重建過程中發揮著極其重要的作用，可以通過控制免疫細胞(T細胞、B細胞等)的增殖、分化和活化來進行免疫調節，促進傷口愈合以及血管生長。

VEGF，是對血管內皮細胞具有高度特異性的血管源性生長因子，由血小板、血管平滑肌細胞、內皮細胞、成骨細胞或腫瘤細胞等合成和分泌，對于新血管形成至關重要，具有增加血管通透性和促進內皮細胞增殖等功能，還具有保護神經的作用。

FGF，是一組具有相似結構特征的多肽，廣泛存在于機體組織內，具有很強的促細胞分裂和增殖活性的作用，可誘導毛細血管的生成。

圖為：動畫示意，SIS材料中富含I、III 型膠原、纖維連接蛋白和多種生長因子(TGF-β、VEGF和FGF等)

提取方法介紹

方法一：稱取SIS材料粉碎后樣品5mg，加入1mL Buffer 1，高速低溫勻漿20~30 min 至液體呈膠體狀，14000 rpm 高速離心30 min，提取上清液，定容到1mL，4℃保存。

方法二：稱取SIS材料粉碎后樣品5 mg，加入1mL Buffer1，高速低溫勻漿20~30 min至液體呈膠體狀，于4℃勻速攪拌24 h，14000 rpm 高速離心30 min，提取上清液，定容到1 mL，4℃保存。

ELISA 檢測法

TGFβ1和VEGF采用雙抗夾心ELISA法，FGF2采用競爭抑制ELISA法。

將兩種方法處理的樣品按ELISA試劑盒說明書操作，操作步驟如下(以TGFβ1為例)：

1) 加樣：分別設置標準孔、待測樣品孔、空白孔，依次加入100μL不同濃度的標準品和樣品，空白孔加標準品緩沖液，酶標板覆膜后37℃溫育1 h，棄去液體后甩干；

2) 每孔加檢測溶液A工作液100μL，37℃溫育1 h，棄去液體，每孔用350μL洗滌液洗滌1~2 min并甩干，該過程重復3次；

3) 每孔加檢測溶液B工作液100μL，37℃溫育1 h，棄去液體，每孔用350μL洗滌液洗滌1~2 min并甩干，該過程重復5次；

4) 每孔加90μL TMB底物溶液，37℃避光顯色(10~20 min)，每孔加50μL終止溶液終止反應，輕輕搖勻；

5) 立即用酶標儀在450nm波長測量各孔的光密度值(O.D.值)；

6) 根據標準品建立標準曲線，代入公式得到樣品中活性生長因子含量，再換算成其在 SIS 補片樣品干重中的含量。

檢測結果

TGFβ1檢測結果

根據ELISA試劑盒不同濃度的TGFβ1標準品在450nm波長下的光密度值(O.D.值)做成標準曲線，如圖1所示。

圖1為：不同濃度 TGFβ1 標準品的 O.D.值標準曲線

如圖2所示，通過方法一檢測SIS中TGFβ1的含量為5391±370 pg/g，方法二檢測SIS中TGFβ1的含量為8375±2125 pg/g。

圖2:兩種處理方法的 TGFβ1 檢測結果對比

VEGF檢測結果：

根據ELISA試劑盒不同濃度的VEGF標準品在450nm波長下的光密度值(O.D.值)做成標準曲線，如圖3所示。

圖3：不同濃度 VEGF 標準品的 O.D.值標準曲線

如圖4所示，通過方法一檢測SIS中VEGF的含量為3974±871pg/g，方法二檢測SIS中VEGF的含量為5486±1043 pg/g。

圖4為：兩種處理方法 VEGF 檢測結果對比

FGF2 檢測結果

根據 ELISA 試劑盒不同濃度的 FGF2 標準品在 450 nm 波長下的光密度值(O.D.值)做成標準曲線，如圖 5 所示。

圖5為：不同濃度 FGF2 標準品的 O.D.值標準曲線

如圖6所示，通過方法一檢測SIS中FGF2的含量為3990±1372 pg/g，方法二檢測SIS中FGF2的含量為2668±384 pg/g。

圖6為：兩種處理方法 FGF2 檢測結果對比

結論

生長因子對提取條件要求非常嚴格，不同的生長因子由于其種類和作用機制的不同，其適宜的提取方法也不盡相同。該實驗通過對 SIS 材料生長因子的預處理方法的比較，得到三種生長因子(TGFβ1、VEGF、FGF2)最適宜的提取方法并檢測其含量。其中博輝SIS中 TGFβ1的的含量為8375±2125 pg/g、VEGF的含量為5486±1043 pg/g、FGF2的含量為3990±1372pg/g。

創面愈合是一個復雜的生物學過程，生長因子在改善各種生理和病理狀態、促進組織再生、修復及創傷愈合過程等方面發揮著重要的作用，在促進肉芽組織形成的同時，加速創面再上皮化進程。

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